猪繁殖和呼吸综合症诊断方法
Diagnostic methods of porcine reproductive and respiratory syndrome
中华人民共和国国家尺度 GB/T18089-2000
2000-04-26发布2000-10-01实施
国家质量技术监视局发布
前言
猪繁殖和呼吸综合症（简称PRRS）是由PRRS病毒引起一种接触传染性疾病。各种春秋的猪均易感染。妊娠母猪感染后可引起流产、死胎、木乃伊胎及弱胎，仔猪可发生呼吸障碍和高病死率，其他猪常呈隐性感染或仅泛起轻度的呼吸道症状。PRRS病毒欧洲型和美洲型两种主要抗原型，分别以LV和VR-2332为代表株，型间具有显著的抗原交叉反应性。据现有资料，我国流行的毒株为美洲型。本病几乎发生于世界各养猪国家，并于九十年代中期传入我国。因为其对养猪业的严峻威胁性，国际兽疫局（1996）已将本病例为B类传染病。
大连动植物检疫局在海内率先开展了PRRS的研究工作，建立了具有与国际平等水平的病毒分离鉴定、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法。其他单位也接踵建立了多种酶联免疫吸附试验等。
本尺度是在综合我国科研成果的基础上，参照国际兽疫局（OIE）编写的《哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗尺度手册》（第三版，1996）编写的。其技术内容与OIE所推荐的基本一致。
本尺度的附录A、附录B和附录C都是尺度的附录。
本尺度由农业部提出。
本尺度起草单位：中华人民共和国大连动植物检疫局。
本尺度起草人：孙颖杰、苏长生、潘凤城、孙延峰、简中友。
1 范围
本尺度划定了猪繁殖和呼吸综合症（PRRS）的诊断方法。
本尺度合用于猪繁殖和呼吸综合症的诊断。
2 诊断方法和种类和选用
PRRS的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊必需依赖实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接免疫荧光试验（IFA）、间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）和血清中和试验（SN）等。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。其余4种方法主要用于检测PRRS病毒抗体。IPMA、IFA和间接RLISA三者特异性相似，但以间接ELISA的敏感性最高。应用这三种方法一般不易区别病毒的抗原类型，故多合用于确定病性。SN反应具有显著的抗原型别差异，因此，它既合用于确定病性，也合用于鉴定病毒的抗原类型。中和抗体泛起最晚，不适合于早期诊断。
本尺度指定上述五种实验室诊断技术为我国进出境和海内生猪PRRS的诊断方法，保证了我国对PRRS的诊断与国外的一致性。在实际应用时，可根据需要和前提，从中选用1~2种方法即可。
3 病毒的分离与鉴定
3.1材料预备
3.1.1器材：96孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳（CO2）恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径0.2μm的微孔滤膜、普通光学显微镜。
3.1.2试剂：RPMI1640营养液、犊牛血清、青霉素（104IU/mL）与链毒素（104μg /mL）溶液、7.5%碳酸氢钠溶液等。
3.1.3细胞培养物：猪原代肺泡巨噬细胞培养物（PAM）或MARC-145或HS2H细胞。PAM由无PRRS猪获取，并经批次检修合格，制备和检修方法见附录B。MARC-145或HS2H细胞由国家指定单位提供。
3.1.4样品
3.1.4.1样品的采取和送检：在发病早期，无菌地采取病猪的血清或腹水。对病死猪（如流产的死胎）和扑杀猪（如弱胎猪），应立刻采限取肺、扁桃体和脾等组织数小块，置冰瓶内立刻送检。不能立刻检查者，应放—25℃~—30℃冰箱中，或加50%甘油生理盐水，4℃保留送检。
3.1.4.2样品的处理：血清和腹水处可直接使用。肺、脾和扁桃体等组织可单独使用，也可混合使用。各组织剪碎后研磨成糊状，加入RPMI1640营养液，制成10%悬液，3000×g离心15min，吸取上清液，加入青霉素500IU/ml、链霉素500μg /ml、庆大霉素500μg /mL和两性霉素B200μg /mL。怀疑有细菌污染的样品，也可用0.2μm微孔滤膜过滤处理。
3.2操纵方法
3.2.1稀释样品：取96孔细胞培养板每孔加入细胞培养液RPMI1640（含犊牛血清10%、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml、两性霉素B10μg/ml、PH=7.2）90 μl，在A1和C1孔内加入统一份已处理的样品各10μL（样品10×稀释）。将板轻轻摇动后，从A1和C1排孔各取10μL分别移入B1和D1排孔内（样品10×稀释）。除第6和第12列留作正常细胞对照外，其他各孔的样品稀释方法同上。振动稀释板后加盖，置4℃冰箱内保留备用。
3.2.2制备细胞板：已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离物特别是欧洲型病毒株的良好生长，因此病毒分离应首选PAM细胞，先将PAM细胞泥用细胞培养液RPMI1640稀释，使细胞终浓度为1×106细胞/ml，或将MARC-145或HS2H细胞营养液稀释，细胞终浓度5×104细胞/ml。然后，在另一块96孔细胞培养板上每孔加入上述细胞悬液100μL。
按照上述操纵，每板可检测20份样品，每份样品重复2个滴度。第6和第12列留作正常细胞对照（不接种样品）。
3.2.3接种样品：由样品稀释板每孔内各吸取稀释的样品液50μL，接种于已形成细胞单层的细胞板相应的孔内（第一代）。细胞板加盖后，放入37℃5%二氧化碳保湿恒温箱中培养，天天观察致细胞病变作用（CPE），连续观察2d~5d。CPE通常在接种后1d~4d内泛起，主要呈现细胞圆缩、会萃、固缩，最后溶解脱落。
3.2.4培养物盲传：根据第一代培养物CPE泛起的情况（通常在接种后的第2d~3d）铺排盲传。盲传时，不论CPE有无，一律各取孔内混悬液25μL，移入新细胞板相应的孔内。再于37℃5%二氧化碳保温恒箱中培养2d~5d,天天观察CPE。
3.3结果的判定和解释